Sắc ký lỏng HPLC là một kỹ thuật để tách hỗn hợp các chất thành các thành phần riêng biệt dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (thường là chất lỏng) và pha tĩnh (thông thường là các chất rắn). Pha động mang theo chất phân phân tích di chuyển qua pha tĩnh đứng yên.
Các thành phần trong mẫu tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn so với các thành phần có tương tác yếu hơn.

Sơ đồ nguyên lý cơ bản hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng sắc ký lỏng cột được cải tiến, thay vì dung môi chảy dưới áp suất của trọng lực, dung môi chảy với áp suất cao lên tới 400 atm, làm tăng tốc độ chảy của dung môi pha động.
HPLC hoạt động với nguyên tắc cơ bản: tách một mẫu gồm hỗn hợp thành phần thành các bộ phận cấu thành của nó dựa trên sự khác biệt về ái lực giữa các phân tử khác nhau với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách.
Phân loại
Trong sắc ký HPLC phân loại dựa trên cơ chế tách của pha tĩnh có các loại sau:
1. HPLC thuận (NP-HPLC)
Sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực. Pha tĩnh thường là silica, Pha động điển hình là hexane, methylene clorua, chloroform, dietyl ete và hỗn hợp các chất này.
Các chất phân cực được giữ lại trên bề mặt cực của cột pha thuận lâu hơn, các chất không phân cực ra khỏi cột trước .
2. HPLC pha đảo (RP-HPLC)
Pha tĩnh không phân cực (kỵ nước), trong khi pha động là chất lỏng phân cực, ví dụ hỗn hợp nước và metanol hoặc acetonitril.
Ngược lại với pha thuận, các chất không phân cực được giữ trên cột pha đảo lâu hơn nên ra ra khỏi cột sau.Các chất phân cực đi ra cột trước.
3. HPLC rây phân tử
Cột được nhồi bằng các vật liệu có kích thước lỗ rỗng chọn lọc chính xác và các hạt được phân tách theo kích thước phân tử của nó. Các phân tử lớn hơn nhanh chóng được rửa qua cột; các phân tử nhỏ đi qua các lỗ rỗng của hạt nên đường đi lâu hơn và đi ra cột lâu hơn
4. HPLC trao đổi ion
Bề mặt pha tĩnh được phủ bởi các điện tích ion tích điện trái dấu với các ion mẫu. Kỹ thuật này được sử dụng gần như độc quyền với các mẫu ion hoặc ion hóa.
Điện tích trên mẫu càng mạnh thì sẽ bị hút mạnh hơn vào bề mặt ion và do đó, nó sẽ được lưu giữ với thời gian hơn để rửa giải. Pha động là các dung dịch đệm, được kiểm soát cả pH và cường độ ion.

Cấu tạo của hệ thống HPLC
1. Bình dung môi
Pha động trong HPLC thường là hỗn hợp các thành phần chất lỏng phân cực và không phân cực có nồng độ tương ứng thay đổi tùy thuộc vào thành phần của mẫu.
2. Bơm - Bộ phận phân phối dung môi
Bơm pittong hút pha động từ bình dung môi đẩy vào hệ thống qua các bộ phận tiêm mẫu, cột và đầu dò sau đó qua bình đựng dung môi thải. Tuỳ thuộc vào các cấu hình hệ thống (ví dụ kích thước cột, kích thước hạt của pha tĩnh, tốc độ chảy và thành phần của pha động) áp suất vận hành ở 6000psi (413 bar) có thể lên tới 18 000 psi (1240 bar).
3. Bộ tiêm mẫu
Bộ phận tiêm mẫu có thể là bộ phận tiêm mẫu tự động hoặc tiêm mẫu bằng tay có bộ phận kim phun. Kim phun mẫu cho hệ thống HPLC sẽ cung cấp việc tiêm mẫu chất lỏng trong phạm vi 0,1-100 mL thể tích với độ tái lập cao và dưới áp suất cao (lên đến 18 000 psi).
4. Cột
m.mCột phân tích thường được làm bằng thép không gỉ, dài từ 50 - 300 mm và có đường kính trong từ 2 - 5 mm. Thông thường, Cột được nhồi bằng các hạt silica / silica lai có kích thước từ 2,5 10
Trong quá trình hoạt động, nhiệt độ của pha động và cột nên được giữ ổn định trong quá trình phân tích. Vì vậy trong thực tế, các hệ thống có thêm buồng điều nhiệt cột.
5. Đầu dò - Detector
Detector nằm ở cuối cột có nhiệm vụ phát hiện các chất phân tích khi chúng được rửa giải từ cột sắc ký. Các đầu dò thường được sử dụng là máy UV-VIS, huỳnh quang, khối phổ, tán xạ bay hơi
6. Thiết bị thu thập dữ liệu
Tín hiệu từ đầu dò có thể được thu thập trên máy ghi biểu đồ hoặc bộ tích hợp điện tử khác nhau với các phần mềm lưu trữ, phân tích và xử lý dữ liệu sắc ký.
Các ứng dụng của HPLC
Thông tin thu thập được qua hệ thống HPLC bao gồm độ phân giải, định lượng hợp chất. HPLC cũng hỗ trợ trong việc tách hóa chất và tinh chế.
Ngoài ra, sử dụng HPLC trong các ứng dụng bao gồm:
Ứng dụng dược phẩm
1. Để kiểm soát sự ổn định của thuốc.
2. Nghiên cứu dược động học của các dạng bào chế dược phẩm.
3. Kiểm soát chất lượng dược phẩm.
Ứng dụng môi trường
1. Phát hiện các hợp chất phenolic trong nước uống.
2. Theo dõi sinh học các chất ô nhiễm.
Ứng dụng trong Pháp y
1. Định lượng thuốc trong mẫu sinh học.
2. Xác định steroid trong máu, nước tiểu,
3. Phân tích về thuốc nhuộm ngành dệt .
4. Xác định cocaine và các loại thuốc khác trong máu, nước tiểu..
Ứng dụng trong Thực phẩm
1. Định lượng chất lượng nước giải khát và nước.
2. Phân tích đường trong nước ép trái cây
3. Phân tích các hợp chất đa vòng
4. Phân tích chất bảo quản
Ứng dụng trong xét nghiệm lâm sàng
1. Phân tích nước tiểu, phân tích kháng sinh trong máu.
2. Phân tích bilirubin, biliverdin trong rối loạn gan.
3. Phát hiện Neuropeptide nội sinh trong dịch ngoại bào của não...

Nguồn:http://thanglonginst.com/